常規反相分析色譜柱柱清洗與再生的推薦步驟：
壓力升高，色譜柱峰形發生變化如出現嚴重拖尾、肩峰甚至峰分岔，分離度降低，這些都強烈提示色譜柱受到污染。可采用以下步驟處理：
1. 如系統接有在線過濾器和保護柱，首先排查在線過濾器與保護柱，進行更新替換。日常操作中，當壓力升高10%或柱效降低10%時，就應考慮更換在線過濾器和/或保護柱。
2. 使用高比例的有機溶劑進行沖洗(請注意避免鹽析出，通常可使用梯度升高法，然后維持在高比例甚至100%有機溶劑條件下)。此操作通常可洗去大部分污染物。
3. 如有機溶劑清洗不能解決問題，可采用如下方法進行色譜柱的清洗和再生。根據樣品性質以及你所了解的污染物性質選擇清洗方法，用20倍柱體積(即，對于4.6x250 mm柱，相當于80 mL)的HPLC級溶劑清洗色譜柱，將流動相溫度升至35-55℃可提高清洗效率。
極性樣品 | 非極性樣品 | |
1.水 | 1.異丙醇* | 選擇1：連續進幾針DMSO(二甲基亞砜)，以溶解柱頭析出樣品 |
2.甲醇 | 2.THF** | |
3.THF* | 3.二氯甲烷** | 選擇2：10-90%B梯度沖洗，其中A為0.1%TFA水溶液，B為0.1%TFA乙腈。 |
4.甲醇 | 4.正己烷 | |
5.水 | 5.異丙醇 | 選擇3：使用7M鹽酸胍或7M尿素水溶液(配制后膜過濾)沖洗色譜柱，促使柱上吸附蛋白樣品變性溶解。 |
6.流動相 | 6. 流動相 |
* 注意防止緩沖鹽析出，可調整為適當比例的異丙醇和水的混合溶液
** 除非確保您的系統與*和正己烷完全兼容，否則*或正己烷只有在色譜柱無法用反相有機溶劑如乙腈清洗干凈時才考慮使用。降低流速及操作溫度，并盡量減少系統在*和正己烷中的暴露時間。
4. 可以考慮對色譜柱進行倒沖，特別是當問題表現為壓力急劇升高，提示有顆粒型物質直接堵塞于色譜柱入口端篩板處時。操作時，將色譜柱倒接，并與檢測器斷開。使用低流速0.2 ml/min，進行過夜沖洗，并封堵檢測器入口及出口端以免溶劑揮干產生氣泡。甚或，將色譜柱小心的打開，直接更換柱入口端篩板。注意！這類操作需要技巧，僅作問題確實無法得到有效解決時的最后嘗試，或供某些經驗豐富的分析操作人員參考使用。
